AULA PRÁTICA: TÉCNICAS DE SEMEADURA
DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA
PROF. DR. LUIS CARLOS F. CARVALHO
Objetivo: Desenvolver as técnicas básicas de semeadura
de material para isolamento de
germes
Princípio:
Uma população microbiana, sob condições naturais, contém muitas espécies
diferentes.
Os microbiologistas devem ser capazes de isolar, enumerar, e identificar os microrganismos
em uma amostra, para então classificá-los e caracterizá-los.
Os
microrganismos na natureza normalmente existem em cultura mistas, com muitas
espécies diferentes ocupando o mesmo ambiente.
Ao
determinar as características de um microrganismo, ele deve estar em cultura pura, ou seja, em
que todas as células na população são idênticas no sentido de que elas
se
originaram de uma mesma célula parental.
Em
laboratório, os microrganismos são cultivados ou desenvolvidos em material
nutriente
denominado meio de cultura. O tipo de meio utilizado depende de
vários
fatores
:
- Considerações sobre a origem do material a ser analisado;
- A espécie que se imagina estar presente nesta amostra;
-
As necessidades nutricionais dos organismos.
Material: Alça de platina, meio sólido em placa (ágar Mueller-Hinton, ágar sangue, EMB, etc.,), tubos contendo 10ml de meio Mueller-Hinton, pipetas de 1ml, tubos com 4,5ml de salina estéril, alça de Drigalsky, bico de Bunsen, swab esteril, galeria para tubos de ensaio, placas de Petri estéreis, becker de 100ml com álcool, estufa a 37ºC, banho-maria a 100ºC, material biológico (saliva, sec. nasal, sec. ouvido, sec. orofaringe, fezes, urina, etc.)
Métodos:
Técnica de Esgotamento: A mais utilizada para isolamento de germes em meio sólido (ágar sangue, ágar EMB, etc ), onde se utiliza uma alça de platina, previamente flambada e esfriada.
- Com a alça de platina, tocar suavemente na amostra;
- Passar a alça sobre o meio de cultura em movimento de zigue-zague sem sobrepor aslinha e sem recarregar a alça (tomar cuidado para não ferir o meio de cultura);
-
Incubar as placas a 37ºC por 24 a 48 horas;
Espalhamento “Pour Plate”: Consiste em
fazer uma prévia diluição da amostra e
colocar
em uma placa de Petri vazia e depois derramar o meio sobre a amostra e agitar para
homogenizar a amostra diluída com o meio de cultura.
Técnica:
- Fazer diluição seriada da amostra, ex. 1/10, 1/100 e 1/1000;
- Colocar 1 ml de cada diluição em uma placa de Petri estéril;
- Fundir 10 ml de meio sólido e refriar a 65ºC;
- Derramar sobre a amostra na placa e aplicar movimentos suaves na placa para misturar a amostra com o meio;
-
Esperar o meio solidificar novamente e incubar as placas a 37ºC por 24 a
48 horas.
Espalhamento Pós Plate: Consiste em espalhar a amostra diluída ou não sobre o meio com auxílio da alça de Drigalsky, para obter colônias isoladas.
Interpretação:
Observar as colônias isoladas, caracterizadas pela formação de pontos
isolados
sobre o meio de cultura, após a incubação.
Recomendações
Para Semeadura de Material Biológico:
Para execução de
uma boa semeadura, certas precauções especiais devem ser
observadas pelo manipulador,
com o fim de preservar a pureza do cultivo e minimizar os riscos de
infecção ou intoxicação no Laboratório:
• Todo processo deve ser feito em ambiente
limpo e desinfectado, próximo de uma
chama “azul” de um bico de
Bunsen, ou então dentro de uma câmara de fluxo laminar;
• Alça de platina utilizada para semear, deve
ser flambada antes e depois da semeadura;
• As placas semeadas devem ser incubadas com
tampa invertida para não haver
transpiração do meio sobre a
tampa
• Regular a entrada de ar do bico de Bunsen,
para obter uma chama azul ( zona de
esterilidade);
• Os tubos ou recipientes com meios de cultura,
estéreis ou com material a ser
inoculado, deverão ser
abertos ou manipulados, somente na proximidade da chama
do bico de Bunsen (zona
estéril);
• As manipulações devem ser feitas,
preferencialmente, por trás da chama do bico de
Bunsen.
• As alças ou agulhas, de platina ou
níquel-cromo, devem ser flambadas imediatamente
antes e depois de qualquer
transferência. Elas devem ser flambadas em todo seu comprimento, a
partir de alguns centímetros do cabo de Kolle, até ao rubro, mantendo-as em
posição vertical à chama do bico de Bunsen. Nunca iniciar a flambagem pela
extremidade livre da alça ou agulha. Deixar esfriar nas proximidades da chama;
• Passar, ligeiramente, dentro da chama do Bico
de Bunsen, imediatamente antes e depois da transferência, pipetas graduadas
estéreis, pipeta Pasteur, ou alça de Drigalsky;
• Nunca abrir ou deixar aberto verticalmente os
tubos ou frascos com culturas, incliná-
los a aproximadamente em
ângulo de 30º;
• No caso de tubo com ágar inclinado, este deve
ficar de preferência na horizontal.
Flambar também a boca dos
tubos ou frascos contendo culturas e meios,
imediatamente antes e depois
da transferência;
• Nunca depositar a tampa ou tampão de algodão
dos tubos ou frascos sobre a bancada
ou mesa de trabalho;
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