Objetivo: Familiarizar o aluno com o preparo dos meios de cultura mais usados em microbiologia; Discutir a aplicação de meios específicos para o cultivo de microrganismos distintos
Princípio: Os microrganismos, para um crescimento adequado, necessitam de nutrientes (fontes de carbono, nitrogênio, enxofre, fosfato, etc., ) e condições ambientais favoráveis (pH, pressão osmótica, temperatura, umidade, etc.,).
Meios de cultura são associação qualitativa e quantitativa de substâncias que permitem o cultivo de microrganismos fora do meio natural. Em condições naturais, nos diversos “habitats”, os microrganismos ocorrem em populações mistas. Os meios de cultura permitem isolar os microrganismos para estudo e pesquisa.
Material: Peptona, extrato de carne, ágar-agar, ágar Mueller-Hinton, Caldo BHI, sangue de carneiro desfibrinado, tubos contendo 10ml de ágar-base estéril PH-metron, placas de Petri estéreis, pipetas de 1ml estéril, balança, provetas.
Equipamentos: Autoclave, cronômetro, Banho-Maria a 55ºC
Ágar Mueller Hinton
Modo de preparação:
Suspender 38,0g em 1000ml de água destilada ou deionizada e aquecer até ebulição para dissolver completamente. Esterilizar em autoclave durante 10 min, a 15 atm de pressão (121ºC), esfriar a 50ºC e distribuir em placas de Petri.
Comentários:
Desde o inicio, os microbiologistas aprenderam que podiam cultivar uma grande variedade de bactérias em “caldos”, obtidos pela cocção de tecidos animais ou vegetais. Em 1923, Mueller, tentando definir esta vaga necessidade, em termos de compostos específicos, descobriu o então desconhecido aminoácido, metionina. A nutrição bacteriana tornou-se campo dinâmico durante os anos subsequentes; porém com o reconhecimento da unidade bioquímica, os vários esquemas nutritivos revelaram ser simplesmente pequenas variações de um tema central e o estudo da nutrição bacteriana perdeu muito de seu interesse teórico. Apesar disso, este campo detém sua importância prática e ainda apresenta desafios; por exemplos, o bacilo da lepra, o treponema da sífilis e riquétsias não podem ser cultivados em meios artificiais.
Inicialmente, o único método existente para contagem de bactérias ou para o isolamento de culturas puras (clones), era a diluição até a extinção, isto é, até a perda da infectividade. Um progresso importante foi a introdução dos meios sólidos por Koch. Os materiais usados inicialmente eram pouco satisfatórios: a superfície da batata cortada podia permitir um crescimento confluente, enquanto que a gelatina permanecia sólida apenas em temperaturas relativamente baixas, sendo liquefeita por muitos microrganismos. Assim sendo, Frau Hesse, esposa de um médico e bacteriologista amador alemão, introduziu o ágar, um produto japonês que ela empregava para engrossar as sopas.
O ágar (do malaio “ágar-ágar”) é um polissacarídeo obtido de certas algas marinhas (várias algas vermelhas). Constitui-se primariamente de galactose, com um radical sulfato para cada 10 ou 50 resíduos.
O ágar mostrou-se ideal para formar meios sólidos. Não é tóxico para a bactéria, e muito poucas conseguem atacá-lo. Em concentrações de 1,5 a 2,0% apresentam uma superfície úmida para permitir crescimento, mas seca o bastante para manter separadas as colônias (Excepcionalmente, certos microrganismos móveis, como Proteus, exigem ágar a 5% para impedir a formação do véu. Após a fusão entre 80 e 100ºC, as soluções de ágar permanecem líquidas até 45-50ºC, temperatura que muitas bactérias toleram por alguns instantes; após a solidificação em temperatura ambiente, permanecem sólidas até muito acima de 37ºC. A estrutura fibrosa de um gel é suficientemente compacta para impedir a movimentação de bactérias no seu interior, mas bastante aberta para permitir a difusão, até mesmo de nutrientes macromoleculares.
O meio de
cultura pode
ser líquido
ou sólido,
e em
laboratório geralmente é usado o
Ágar-agar;
Foi-nos apresentados
em laboratório
o Ágar-agar
(polissacarídio complexo
obtido de
alga marinha
vermelha). Ele
é utilizado
como agente
solidificante e altamente nutritivo para
os microrganismos
e não
se degrada
facilmente com
a ação
destes.
Na prática,
usou-se esse
composto misturado
a água
para formar
uma solução
gelatinosa. Para calcular quanto se
deveria usar
do composto,
faz-se uma
regra de
três simples.
O preparo
normal geralmente
é de
1000 ml
de água
para cada
90 gramas
de Ágar-agar
e seguindo
essa regra,
usou- se
13 g
do Ágar-agar
para cada
150 ml,
que foi
devidamente pesado e colocado no
dentro do
erlenmayer para
formar a
solução.
Logo
em seguida
o erlenmayer
foi coberto
com um
papel cartolina
e juntamente
com as
placas de
petri devidamente
embalados foram
colocados dentro
da autoclave.
Seguindo todos
os passos
de segurança
e lacrada
corretamente, a solução preparada foi
esterilizada a
pressão de
1 atm
à 121
°C por
15 min.
