AULA PRÁTICA: COLORAÇÃO DE ZIEHL NEESEN

 

DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA

PROF. DR. LUIS CARLOS F. CARVALHO

Objetivo: Elaborar uma coloração para identificar os Bacilos Álcool-Ácido-Resistentes (BAAR) em material biológico, essencial no diagnóstico laboratorial de doenças infecciosas causadas por micobactérias, tais como tuberculose e Hanseníase.

Princípio: Existem bactérias que são resistentes à coloração, porém quando coradas, resistem fortemente à descoloração, mesmo quando submetidas a ácidos fortemente diluídos e ao álcool absoluto, sendo assim denominadas de bacilos álcool-ácido-resistentes (BAAR). A característica álcool-ácido-resistente é conferida a essas bactérias devido ao alto teor de lipídeos estruturais na parede celular, que causa uma grande hidrofobicidade, que dificulta a ação de corantes aquosos. Um exemplo de ácido graxo altamente presente na parede celular dessas bactérias é o ácido micólico. Na técnica de Ziehl-Neelsen, após o processo de coloração da amostra, a fucsina de Ziehl irá corar todos os elementos celulares de vermelho, porém após a descoloração com o álcool, somente os bacilos álcool-ácidos-resistente irão continuar preservando a cor vermelha, os demais elementos celulares na amostra serão descoradas. Então, para podermos visualizar os outros elementos celulares (descorados) na amostra, deve-se utilizar azul de metileno, que dará um contraste, deixando os elementos celulares em azul e os bacilos álcool-ácidos-resistentes continuarão em vermelho.

Material: Laminas, swab estéril, solução de fucsina fenicada, solução de azul de metileno, solução de HCl a 5% em ácool, lamparina à álcool, fósforo, álcool comercial

Método: 

▪ Fixar a lâmina com o calor; 

▪ Cobrir o esfregaço com fucsina fenicada; 

▪ Aquecer em chama até emitir vapores. A partir disto, iniciar a contagem de cinco minutos; 

▪ Lavar suavemente a lâmina em água; 

▪ Colocar álcool-ácido clorídrico, até que o corante não se desprenda mais (cerca de dois minutos); 

▪ Lavar a lâmina com água; 

▪ Cobrir o esfregaço com azul-de-metileno (durante trinta segundos); 

▪ Lavar a lâmina com água; 

▪ Deixar secar e observar ao microscópio com a objetiva de imersão

PREPARAÇÃO DOS CORANTES 

Corantes de Ziehl – Neelsen 

Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen:

        Na preparação dos corantes de Fucsina fenicada (Ziehl – Neelsen e Kinyoun), dissolver em um gral o corante (Fucsina) no Álcool etílico 95º, juntar aos poucos o Fenol fundido. Misturar sempre de modo a obter uma solução bem homogênea. Juntar a água, pouco a pouco, lavando o gral. Filtrar após 24 horas de repouso. Estocar em frasco escuro. Segundo Langeron, a prática seguida por outros autores de misturar a solução alcoólica saturada do corante com água fenolada não dá soluções tão estáveis e dotadas de poder corante tão intenso como esta técnica descrita acima.

    Observação: Para manter o fenol fundido, adicionar-lhe 15% de água destilada. De tal solução (de água em fenol) , na fórmula acima, tomar-se-ão 5,75 ml ao invés de 5 ml. 

Álcool-Ácido:

Com uma pipeta deixar escorrer o Ácido clorídrico pelas paredes do frasco contendo o Álcool e agitar suavemente. 

Observação: 

Alguns autores recomendam Álcool-Ácido à 1%.

Azul de metileno:

Dissolver o Azul de metileno com Álcool por agitação e juntar Água destilada ou deionizada até completar 100 ml. Deixar repousar por 24 horas. Filtrar e estocar em frasco escuro.