AULA PRÁTICA: COLORAÇÃO DE GRAM
DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA
PROF. DR. LUIS CARLOS F. CARVALHO
Em 1884, o médico Dinamarquês Cristian Gram descobriu, empiricamente, ao corar cortes histológicos com violeta genciana, através do método de Ehrlich (1882), que as bactérias que eles continham não eram descoradas pelo álcool, se previamente tratadas com solução de iodo. Ele adicionou a este procedimento um contra-corante (safranina, fucsina básica, etc.,) e estabeleceu, a partir daí, uma metodologia de coloração diferencial.
Ao longo destes anos, o mecanismo de coloração de Gram foi sobejamente estudado. E nesta medida, muitas modificações foram propostas, sem contudo, afetar substancialmente a ideia original.
Os microrganismos respondem diferentemente ao método. Há os que retém o pigmento característico do corante (cristal violeta) em vista da formação de um complexo com a solução iodo-iodeto (lugol), apesar da lavagem com álcool ou acetona, motivando uma desidratação da parede celular, diminuição da porosidade e da permeabilidade. São os Gram-positivos. E há os que permitem a remoção do pigmento do corante pela lavagem com álcool ou acetona, em decorrência da extração de lipídios da parede, o que leva a um aumento da porosidade celular. São os Gram-negativos. Tratando, os dois grupos, com contra-corante (safranina ou fucsina básica) observa-se que as células do primeiro (Gram-positivos) não são afetadas e permanecem azuis ou violeta; enquanto que para o outro (Gram-negativos) as células absorvem o contra-corante, tornando-as vermelhas.
A parede celular bacteriana apresenta particularidades na sua composição química. Este dado é absolutamente coincidente com a resposta à reação de Gram. A presença de maior teor de peptidoglicano nos Gram-positivos, tem sido apontado como fator determinante da retenção do complexo ao nível de parede. Tanto assim que os protoplastos, produzidos por ação de lisozima ou por efeito de penicilina sobre os Gram-positivos, não são capazes de reter o pigmento, após lavagem com álcool ou acetona. Portanto, a reação de Gram resulta essencialmente das interações do complexo, cristal violeta ou violeta de genciana e iodo, com o peptideoglicano da parede celular, numa combinação ainda não de todo esclarecida, na qual a presença de ribonuclease de magnésio é mediadora da fixação do corante.
A reação de Gram tem largo relacionamento com o estado fisiológico da célula. As culturas jovens respondem melhor à diferenciação tintorial. As culturas velhas de Gram-positivas podem se apresentar como Gram-variável, pela perda da capacidade de retenção do corante.
A coloração é hoje empregada com elevado significação taxonômica. Assim, são Gram-positivos quase todos os bacilos esporulados, móveis por flagelos peritríquios e a quase totalidade dos cocos. São Gram-negativos a quase totalidade dos bacilos não esporulados, móveis por flagelos peritríquios ou polares, e todas as espiroquetas, apenas para citar alguns exemplos.
Questões
1. A coloração de Gram possibilita caracterizar as bactérias quanto ao comportamento tintorial (Grampositiva e Gram-negativa), morfologia (cocos, bacilos, espirilos) e arranjo (em cacho, em cadeias, aos pares). Qual o significado destas informações para a medicina?
R: São necessárias para identificar o diagnóstico e tratamento das doenças infecciosas.
2. A coloração de Gram exerce alguma importância em diagnósticos clínicos de bactérias isoladas de infecções humanas e animais? Citar pelo menos um exemplo.
R: Sim, porque a A coloração de Gram pode prever o tipo de bactéria que causa uma infecção, como pneumonia pneumocócica ou abscesso estafilocócico.
3. Empiricamente, Gram estabeleceu uma sequência para a aplicação dos corantes que integram a metodologia. Comentar os resultados possíveis de serem obtidos com as inversões da sequência referida no método.
R: Esquecer de descorar com alcool-acetona: As bactérias Gram-negativas serão observadas de cor roxa (violeta);
4. Sabe-se que se a parede celular é o sítio preferido pela fixação da reação de Gram. Fazer um esquema mostrando esta associação, para o caso típico de uma bactéria Gram-positiva.
5. Sendo o Gram um método de coloração diferencial, como esta reação pode ser empregada para a verificação do estado de pureza de uma determinada cultura?
R: A realização periódica do exame de uma cultura pura demonstra que todas as colônias apresentam a mesma característica morfo-tintorial.
6. Comente o efeito da penicilina sobre a parede celular bacteriana, correlacionando-o com a reação tintorial de Gram.
R: A penicilina agem sobre a parede celular, causando ruptura e consequentemente altera todas as características morfotintoriais observada na coloração de Gram.
7. Comente a frase: “Uma bactéria Gram-negativa pode tornar-se Gram-positiva, dependendo do tempo de incubação da cultura, mas o inverso não é verdadeiro".
R: A característica tintorial de Gram-negativa é devido a presença da membrana externa, que pode ser perdida em certas condições de cultivo desfavorável, fazendo com que a bactéria apresente característica de Gram-positiva (roxa), mas o contrário não é possível porque uma bactéria Gram-positiva jamais adquire a membrana externa, ou seja, uma vez, Gram-positiva, sempre Gram-positiva.
