AULA PRÁTICA: COLORAÇÃO SIMPLES

 

DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA

PROF. DR. LUIS CARLOS F. CARVALHO

Princípio: A coloração simples tem bases físico-químicas. A impregnação de uma célula por um corante pode ser entendida a partir de fenômenos como a capilaridade, osmose, adsorsão e absorção. Mas, é sobretudo pela compreensão de certas reações de corantes de organóides, inclusões e estruturas celulares que se firmam as bases desta metodologia. Desta forma é observada uma reação estequiométrica entre corantes e uma dada estrutura, por força da afinidade de suas cargas opostas. Normalmente o que é uma reação de dupla troca de cátions e anions, do tipo: 

(Microrganismos)- (Na+ , K+ , etc) + (cromóforos) → (microrganismo)- (cromóforos) + + (Na+ K+ , etc. ) + (Cl- , oxalato, etc) Material: Material biológico2 em suspensão, lâminas, lamínulas, microscópio, pipeta Pasteur (ou contagotas), corante (azul de metileno, verde malaquita, Giemsa, etc)

Material: Material biológico em suspensão, lâminas, lamínulas, microscópio, pipeta Pasteur (ou contagotas), corante (azul de metileno, verde malaquita, Giemsa, etc) 

Método: Fazer um esfregaço com o material biológico. Esperar secar. Fixar ao calor . Cobrir o esfregaço com o corante. Esperar por 1 a 5 min. Lavar com água, secar o observar ao microscópico com objetiva de imersão. 

Interpretação: Anotar as suas observações, tais como presença de células, afinidade pelo corante, forma e disposição dos microrganismos, etc.

Comentários: Sob o ponto de vista químico, os corantes são substâncias orgânicas possuidoras de grupamentos cromóforos que podem conferir aos corpos celulares uma dada pigmentação. Os corantes são classificados em três grupos, de acordo com a carga do íon da porção corante da molécula. Assim, são corantes ácidos os que têm uma carga negativa; básicos os que tem cargas positivas e neutros os que são, portanto, eletricamente neutro. 

Em bacteriologia, os corantes básicos são os mais empregados. Isto justifica-se pela presença de cargas elétricas, negativas, ao longo do corpo celular, o que demonstra a afinidade por este tipo de corantes.

Iniciamos o processo de coloração simples realizando um esfregaço de cera de ouvido, com o auxílio de cotonete, na lâmina. 

Com o auxílio de um prendedor de roupa, pegamos a lâmina com o material biológico e o aquecemos com uma vela acesa.

Após isso, cobrimos o material com o corante azul metileno, e aguardamos 5 min.

Lavamos levemente a lâmina com água e esperamos secar. 

O corante facilitou a visualização do material, por meio do microscópio, deixando em evidência as estruturas de micro-organismos que não eram possíveis visualizar apenas aplicando na lâmina.

Questões: 

1. Os meios de cultivo e a idade da colônia exercem alguma influência na morfologia de células em coloração simples?

R: O meio de cultura é uma preparação muito utilizada em laboratórios, que tem por objetivo fornecer aos micro-organismos o local perfeito para o seu crescimento. A idade de colônia é uma unidade de medida usada para estimar o número de bactérias ou fungos viáveis - isto é, capazes de se multiplicar mediante fissão binária sob condições controladas - de uma amostra. O objetivo básico da coloração simples é mostrar toda a estrutura do microrganismo incluindo a forma e as estruturas básicas.

De forma resumida, a coloração simples, por afinidade a alguns componentes de determinadas bactérias, permitirá a melhor visualização destas. Porém há informações e preparos que devem ser feitos para que a coloração seja realizada de maneira correta, como os que são citados no enunciado. 

2. A coloração simples se presta a identificação de uma cultura mista de microrganismos? Que observações poderiam ser obtidas? 

R: O objetivo é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis. É mais frequentemente usada na verificação das características morfológicas das bactérias. Apresenta vantagens como: células mais facilmente visíveis após coloração, podem ser evidenciadas diferenças entre células de diferentes espécies ou dentro da mesma espécie pelo uso de soluções corantes apropriadas.

3. Qual a aplicação da coloração simples no Diagnóstico Laboratorial de doenças infecciosas? 

R: As bactérias, que podem causar doenças infecciosas, são praticamente incolores, não apresentando contraste suficiente, o que dificulta sua visualização. A diferença química entra as bactérias e o meio é que nos permite distingui-las por técnicas de coloração. O exame microscópico do tecido pode ser necessário para distinguir doença invasiva de colonização de superfície. A distinção não é facilmente alcançada por métodos de cultura. 

4. Cite exemplos de Doenças Infecciosas e seu agente infecioso que são diagnosticados seguramente por uma coloração simples? 

R: Parasitas no sangue; Histoplasma capsulatum nos fagócitos e nas células teciduais; Inclusões intracelulares formadas por vírus e clamídias; Trofozoítos de Pneumocystis jirovecii; algumas bactérias intracelulares 

5. Cite alguns cuidados, a serem tomados para a execução satisfatória da coloração simples.

R: Para que a coloração seja apresentada corretamente, deve-se cumprir as etapas de preparação com veemência, atentando-se para o manejo correto do esfregaço, que deve estar fixado e coberto com a solução corante por aproximadamente cinco minutos, após o qual a lâmina é lavada com água e devidamente seca. As células geralmente se coram uniformemente. Usar um dos corantes: Cristal violeta, azul de metileno, safranina. Atentar-se para o uso de máscara, luva e touca para não contaminar o material biológico.