AULA PRÁTICA: TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS (ANTIBIOGRAMA)

DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA

PROF. DR. LUIS CARLOS F. CARVALHO

Objetivos: Determinar a susceptibilidade de microrganismos a diferentes antibióticos por meio da técnica de difusão em ágar. Interpretar um antibiograma em função do diâmetro do halo de inibição de diferentes antibióticos.

Princípio: Os antibióticos impregnados nos discos, difundem no ágar e formam um halo de inibição ao seu redor quando encontram bactérias sensíveis. A bactérias resistentes crescem próximo ao disco, não ocorrendo a formação de halo.

Material: Placas contendo ágar Mueller-Hinton, Microrganismo isolado em cultura pura (E.coli ou S.aureus) e suspenso em salina (inóculo).

Método:

Preparo do inóculo: Tomar 4 a 6 colônias do cultivo puro e inocular em um tubo com caldo BHI. Incubar o tubo por 2 a 5 horas até obter uma suspensão com turvação moderada. O inóculo deve ser adequadamente padronizado, pois caso contrário o resultado do antibiograma poderá ser alterado significativamente. Preparar as diluições de cada cultura em solução salina fisiológica até que a turbidez das suspensões ajustem-se a 108 bactérias/ml. Comparar as suspensões contra um padrão de turvação (0,5ml de BaCl2.2H2O 0,048M em 99,5ml de H2SO4 0,36N) preparado mensalmente.

Semeadura: Utilizar um “swab” estéril para cada cultura, imergindo-o no “inóculo”. Esgotar o excesso de líquido, apertando o “swab” contra a parede do tubo e semear cada microrganismo em ágar Mueller-Hinton em diferentes sentidos, assegurando uma semeadura uniforme.

Aplicação dos discos: Mantendo sempre a assepsia, depositar com uma pinça estéril (imersa no álcool ou flambada na chama) os discos de antibióticos indicados sobre a superfície do inóculo em placa de ágar. Em seguida, com pinça estéril, exercer uma leve pressão sobre cada disco, para se obter uma boa aderência, a fim de permitir um contato do disco com a superfície do ágar. Caso contrário, poderá ocorrer erros na leitura dos resultados, devido a difusão não uniforme do antibiótico no ágar. Não se deve colocar mais de 9 discos por placas de 100mm, assim como, é muito importante levar em conta a distância entre eles.

Incubação: Depois de trinta minutos, as placas devem ser incubadas invertidas a 37ºC durante 16 a 18 horas.

Leitura: Observar e medir o halo de inibição, comparando com a tabela em anexo para determinar a susceptibilidade aos antibióticos: S (Sensível), R (Resistente) e I (Intermediário).

Interpretação:

A interpretação dos resultados do antibiograma pelo método dos discos de concentração única é baseada na correlação existente entre os parâmetros seguintes, verificados com relação a diferentes cepas bacterianas:

a) Concentração mínima inibitória (C.M.I.) - dose mínima de antibiótico que, adicionada ao meio de cultura (líquido ou sólido), é capaz de inibir totalmente o crescimento de um inoculum estândar.

b) Zona de inibição ( Z.I.) - diâmetro do halo estéril em torno do disco, em placas semeadas com as mesmas cepas bacterianas.

A observação clínica permitiu estabelecer, ademais, os valores de C.M.I. correspondentes ao
sucesso terapêutico, de sorte que é possível inferir, pelo valor de Z.I., qual o antibiótico de escolha para a cepa bacteriana em questão.

Comentários

Discos utilizados no teste:

O método estândar recomendado pela “Food and Drug Administration” dos Estados Unidos utiliza discos de concentração única, que devem ser conservados ao abrigo da umidade (dessecadores) e em temperatura baixa (3ºC ou - 14ºC, conforme o caso). Utilizam-se discos de concentração única e adequada, para cada antibiótico, à obtenção de halos de inibição indicadores do grau de sensibilidade de diferentes bactérias: penicilina (P), bacitracina (B) – 10UI.; ampicilina (A), colistina (C), estreptomicina (S), gentamicina (G), rifampicina (R), viomicina (VI) - 10 mcg; eritromicina (E), oleandomicina (OL) - 15 mcg; cefalotina (CE), cloranfenicol (CL), declomicina (D), gabromicina (GB), kanamicina (K), a. nalidíxico (NA), neomicina (N), novobiocina (NO), rovamicina (RO), tetraciclina (T), vancomicina (V) - 30 mcg; sulfas em geral, furadantina (F) - 300 mcg, etc.

Multidiscos são oferecidos em numerosas combinações, para atender a diferentes objetivos: infecções urinárias, feridas supuradas, etc.

Antibiograma - Métodos Convencionais

Uma das tarefas mais importantes do laboratório de microbiologia clínica é avaliar a sensibilidade de microrganismos a antimicrobianos. O objetivo dos testes que fazem esta avaliação é prever, através da realização de provas “in vitro”, a probabilidade de sucesso terapêutico no uso das drogas avaliadas no tratamento de infecções causadas pelo microrganismo a ser testado. O desenvolvimento de novos e variados mecanismos de resistência pelos microrganismos tem gerado o surgimento de um número cada vez maior de antimicrobianos. Esses dois fatores tem levados à necessidade de aprimoramento constante dos testes de sensibilidade a antimicrobianos. Existem varias opções para avaliação de sensibilidade a antimicrobianos, tais como disco-difusão, microdiluição em caldo, métodos rápidos automatizados e, mais recentemente, o E test, que é um teste comercial baseado no método de difusão em ágar.

O método de disco-difusão é o mais utilizado no Brasil e na maioria dos países. Esse teste é realizado através da aplicação de um pequeno disco de papel de filtro impregnado com antimicrobiano a superfície do ágar onde o microrganismo foi inoculado. A difusão do antimicrobiano no ágar levará a formação de um halo de inibição de crescimento. Através da medida do diâmetro desse halo o microrganismo será classificado em resistente (R), intermediário (I) ou sensível (S). É um método bastante simples, fácil de ser realizado e que possui acurácia excelente quando realizado de maneira adequada.

Em resumo, a terapêutica antimicrobiana de infecções causadas por algumas bactérias, fungos, vírus e parasitas continua a ser empírica porque ainda não foram detectados problemas de resistência, ou por falta de alternativas terapêuticas. O rápido aumento na prevalência de infecções causadas por microrganismos resistentes, porém, tem exigido não somente o aprimoramento das técnicas laboratoriais como também o maior conhecimento destas por parte do médico assistente. Este deve reconhecer as situações onde os diferentes testes estão indicados e saber interpretar os resultados fornecidos.

Resumo da Prática:

TSA - Teste de susceptibilidade aos antibiogramas:

- Suspensão de bactérias em solução de soro fisiológico;

- Depois da suspensão de bactérias semeia por espalhamento;

- Depositar os discos de antibióticos;

- No centro da placa, coloca o continente cortado e em cima pinga o antibiótico no cotonete e coloca na estufa (incubar de 37C / 24-48h).

Antibacterianos:

Cefalozina sódica (colocado no cotonete)

Norfloxacin

Amicacina

Penicilina

Meropenem

Pontos que apresentarem halos de inibição significa que a bactéria é sensível ao antibiótico. Se não apresentar, ela é resistente.

AULA PRÁTICA: SIMULAÇÃO DA DISSEMINAÇÃO DE AGENTES INFECCIOSOS TRANSMITIDOS POR CONTATO DIRETO

DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA

PROF. DR. LUIS CARLOS F. CARVALHO

Objetivo:

Geral: Avaliar a dinâmica da disseminação de agentes infecciosos transmitidos por contato direto.

Específicos:

- Fazer uma simulação da disseminação de agentes infecciosos;

- Propor um modelo matemático para estudar a dinâmica da disseminação de agentes

infecciosos em uma população vulnerável;

- Identificar a possível fonte de infecção;

- Determinar a incidência (casos novos) do portador do agente infecciso;

- Determinar a prevalência (casos existentes) do portador do agente infecciso;

Resumo da Prática:

Simulação de como o agente infeccioso transmite de pessoa para pessoa. Teste para descobrir o transmissor de doença.

- Foi distribuído tubos para todas as pessoas da sala, sendo que apenas um deles está contaminado (ninguém sabe qual o tubo de início);

- Em seguida, foi feita a troca do material contido no tubo entre as pessoas;

- No final será realizado o teste para saber quantas pessoas foram contaminadas a partir de um único tubo e quem foi o ponto inicial.

Resultado da Prática:

Cada aluno ficou com um tubo, total de 14 tubos. Realizamos um esquema, juntamente com o professor Luís Carlos, para identificar quem estava infectado a princípio, já que 13 tubos estavam com água e 1 estava com soda cáustica. Após os cálculos, foi descoberto que o tubo de número 6 era o infectado.

METODOLOGIA

Materiais:

19 tubos contendo 2ml de água destilada, 1 tubo contendo 2ml de KOH 40%; 20 swab ou cotonetes e 1 frasco com solução indicadora de fenolftaleína ou outro indicador de pH.

Procedimentos:

- Distribuir os 19 tubos de H20 destilada, o tubo com KOH e os swab para os 20 alunos

voluntários. Cada aluno deverá escolher um colega para ser o seu parceiro. No total serão 10

pares de alunos;

- Os alunos escolherão outro parceiro, formando uma nova dupla e um dos colegas irá repetir o procedimento anterior;

- As trocas de fluidos serão realizadas por 3 ou 4 rodadas. É importante que os alunos anotem a ordem de escolha dos parceiros. No final da última rodada, o Professor irá chamar o aluno que recebeu o tubo com KOH e o submeterá ao “teste diagnóstico”, gotejando 2-3 gotas de uma solução de fenolftaleína no seu tubo, questionando-o sobre o seu primeiro parceiro. Este também submetido ao “teste diagnóstico”;

- O primeiro aluno e o respectivo parceiro serão questionados sobre os parceiros da 2a

rodada, os quais serão testados com fenolftaleína. A partir daí todos os “portadores” serão questionados sobre os parceiros da 3ª rodada e assim sucessivamente (se houver mais rodadas);

- O professor deverá traçar no quadro uma cadeia de transmissão do agente e estimular

discussões sobre a transmissão de agentes infecciosos que envolvam troca de fluidos

biológicos.

COMENTÁRIOS

As doenças podem ser classificadas de acordo com a disseminação, seja bacteriana, viral,

fúngica, ou causadas por demais agentes que se instalam e ocasionam distúrbios na homeostase (equilíbrio orgânico) de um hospedeiro. Entre os critérios de classificação, são considerados fatores como: a incidência relativa ao tempo de desenvolvimento, desde a incubação do agente (contaminação), apresentação de sintomas e cura (caso exista) ou falecimento; e o número de acometimentos de uma determinada patologia por zoneamento (se restrito ou abrangente conforme a territorialidade).

Dessa forma, as disseminações infectopatológicas podem ser diferenciadas da seguinte

forma:

Epidemia: doença que de forma repentina acomete um grande número de indivíduos de uma

limitada região. Pode caracterizar um quadro periódico de surto epidêmico quando, de um

determinado agente etiológico, surge de tempo em tempo uma nova forma infectante (uma estirpe/ linhagem proveniente de processos mutagênicos, comum em organismos cujo ácido nucléico é o RNA).

Exemplo: o vírus que provoca a gripe (doença transitória).

Endemia: representa situações de enfermidade persistentes em uma específica região,

atingindo considerável, constante ou crescente número de indivíduos.

Exemplo: o vírus da dengue (doença que está associada à sazonalidade climática, de maior

incidência durante os períodos de chuva, relativamente acompanhando as distinções de regime pluviométrico entre as regiões territoriais).

Pandemia: disseminação sem limites territoriais, acometendo em um mesmo período um número alarmante de indivíduos em todo o território mundial.

Exemplo: a cólera, doença bacteriana que atingiu o contingente populacional de vários países

PESQUISA DE BACTÉRIAS NO AR (MICROBIOTA AERÓGENA)

Objetivos: Observar as colônias de bactérias que estão circulando no ar de determinado ambiente físico

Princípio: As bactérias chegam em ambientes climatizados tanto pelo ar externo como também através do corpo humano, seu principal hospedeiro onde são expelidas através de tosses e espirros. Quando se expõem uma placa contendo meio de cultura, essas bactérias tendem a se desenvolver formando colônias visivelmente observável, após a incubação das placas a 37 graus celsius por 24 a 48 horas.

Material: placas contendo meio de cultura ( Ágar Mueller-Hinton); alça de platina, lâmina, lamínula, reagentes de coloração de Gram, microscópio e óleo de imersão..

Metodologia:

Expor uma placa contendo ágar Mueller-Hinton no ambiente por 3 a 5 minutos
Incubar a temperatura a 37oC por 24 a 48 horas.
Observar e anotar as características macroscópicas das colônias
Com uma alça de platina retirar um fragmento da colônia, colocar sobre uma lâmina

e corar pela técnica da coloração de Gram;. Observar no microscópio em lente de 100X com óleo de imersão.

Interpretação: Anotar as características macroscópicas e microscópicas das colônias

Comentários

As bactérias chegam em ambientes climatizados tanto pelo ar externo como também através do corpo humano, seu principal hospedeiro onde são expelidas através de tosses e espirros. Quando se expõe uma placa contendo meio de cultura, essas bactérias tendem a se desenvolver formando colônias visivelmente observável, após a incubação das placas a 37o.C por 24 a 48 horas. O Ar é composto por gases nobres como oxigênio e o nitrogênio, incluindo também o vapor de água que é responsável por oferecer um Ar mais leve e saudável para se respirar, porém em ambientes climatizados os fatores que interferem na qualidade do Ar interior tendem a ser diferente dos externos. Em ambientes climatizados os microrganismos são os principais vilões contra a qualidade do Ar, exigindo constante atenção quanto ao processo de renovação do ar e realização da manutenção periódica. Para locais de uso público e coletivo é necessário solicitar a Análise Microbiológica do Ar para detectar não só a presença de microrganismos, como também avaliar a qualidade do Ar interior como um todo.

A Resolução RE 09 ANVISA é rígida quanto a presença de fungos em ambientes climatizados, esta lei determina que o Valor Máximo Recomendável de contaminação microbiológica deve estar entre 750 ufc/m3 de fungos, para a relação I/E < 1,5, onde I é a quantidade de fungos no ambiente interior e E é a quantidade de fungos no ambiente exterior. Ocasiões onde os valores excedam o limite de 1,5 a Resolução RE 09

ANVISA implica que deve ser realizado o controle de possíveis pontos de vazamento de água como paredes com infiltração ou demais focos de vazamento.

Os equipamentos de ar condicionado também são locais propícios para o desenvolvimento de fungos devido suas condições de umidade e temperatura e deve-se realizar de forma periódica a limpeza do equipamento de forma a evitar o desenvolvimento e propagação destes microrganismos.

Ainda dentro da Resolução RE 09 recomenda-se a substituição de vasos de plantas de cultivo em terra pelos de cultivo em água (hidroponia) além de utilizar filtros de ar G-1 pois o mesmo torna mais eficiente o processo de renovação do ar não retendo fungos e outros microrganismos no ar de um ambiente climatizado.

A ABNT indica que filtros de classe F3 são razoavelmente eficientes no combate de alguns microrganismos e outros agentes poluentes do ar interior como fumaças de óleo e tabaco, bactérias e fungos microscópicos. Locais com altos riscos

de contaminação como hospitais, salas de cirurgia, cabinas estéreis e ambientes correlatos, recomenda-se a utilização de filtros de classe A3 que possuem a capacidade de reter poeira atmosférica, fumaças de óleo e tabaco e os principais microrganismos como bactérias, fungos microscópicos e vírus.

A Análise Microbiológica do Aré um procedimento que deve ser solicitado para ambientes climatizados de uso público e coletivo adequando-se aos padrões de qualidade do ar estipulados pela Resolução 09 ANVISA. Através desta análise é possível diagnosticar qual as reais condições do Ar que os ocupantes de um ambiente climatizado estão respirando e em cima disto trabalhar em melhorias para estar de acordo com a Resolução 09 ANVISA evitando multas e o mais importante zelando pela saúde pública.

O processo de Análise Microbiológica do Ar ocorre através da visita de um de nossos coletores ao local, onde recolhe-se amostras de Ar através de nossa aparelhagem específica. Avaliamos parâmetros de temperatura, velocidade, umidade relativa, contagem de aerodispersóides (poeira total) e microrganismos.

Sistemas de Ar condicionado necessitam de cuidados especiais, a manutenção periódica é indispensável tanto no combate quanto para restringir a proliferação de microrganismos indesejáveis em sistemas de Ar condicionado, os cuidados podem variar de aparelho para aparelho, entretanto a Análise Microbiológica do Ar é obrigatória para locais de uso público e coletivo e deve ser realizada de forma SEMESTRAL para ter conhecimento das condições do ar interior em seu ambiente climatizado e então realizar melhorias adequando-se aos padrões de qualidade do ar implícitos na Resolução 09 ANVISA.

O laboratório LBN Análises está a sua disposição para auxiliá-lo nesta etapa de assegurar saúde e segurança ao ar de seu ambiente climatizado, através de nossos

laudos de ensaio torna-se possível detectar a presença de microrganismos entre outros poluentes presentes no ar permitindo a adoção de medidas para elevar os níveis de qualidade do ar adequando sua empresa aos parâmetros de qualidade do Ar estipulados pela Resolução 09 ANVISA.

REFERÊNCIA:
http://www.lbnanalises.com.br/blog/analise-microbiologica-do-ar/, acessado em 01/04/2018

AULA PRÁTICA: BACTERIOSCOPIA - EXAME BACTERIOSCÓPICO

DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA

PROF. DR. LUIS CARLOS F. CARVALHO

Objetivo: Fazer análise bacterioscópico de material biológico para reconhecer as características morfotintoriais das bactérias.

Princípio: O exame bacterioscópico consiste em analisar um esfregaço de material biológico corado pelo método de Gram, onde se observa que as bactérias Gram-positivas, retém o corante cristal violeta e aparecem coradas em violeta-escuro; Bactérias Gram-negativas, perdem o cristal violeta quando tratadas com álcool, são então coradas com o corante safranina e aparecem coradas em vermelho. As caracterizações das bactérias são feitas pela forma, disposição e comportamento tintorial.

Material: Material biológico ( Secreçõoes purulentas, urina, fezes, etc.,).

Reagentes de Gram: sol. cristal violeta 2%; sol. aquosa de iodo (Lugol); mistura álcool-acetona; sol. alcoólica de safranina, Lâminas: Suporte
para lâminas; alça de platina; Bico de Bunsen; Microscópio; Óleo de Imersão.

Método:
- Preparar um esfregaço, fazendo movimento circular com swab na lâmina
- Cobrir a área do esfregaço com a solução de cristal-violeta por cerca de 1 minuto;
- Lavar com água corrente e escorrer o excesso de água;
- Cobrir a área do esfregaço com a solução de iodo durante cerca de 1 minuto;
- Descorar a lâmina com a mistura álcool-acetona, até que o solvente escorra incolor;
- Cobrir o esfregaço com a solução de safranina1 por cerca de 30 segundos;
- Lavar com água corrente;
- Deixar secar ao ar e observar em lente de imersão (100X)

RESULTADOS: Assinale os itens que caracteriza as bactérias observadas.

Comportamento tintorial:

( ) Gram-positiva (x) Gram-negativa

Formas:

(x) Cocos ( ) Bacilos ( ) Espirilos ( ) Vibrios

Disposição:

(x) Cocos isolados e aos pares - Diplococos

( ) Cocos isolados e agrupados em cachos – Estafilococos

( ) Cocos isolados e agrupados em cadeia – Estreptococos

( ) Bacilos isolados e agrupados aos pares – Diplobacilos

( ) Bacilos isolados e agrupados em cadeias – Estreptobacilos

( ) Cocos isolados e agrupados de 4 em 4 – Sarcina

( ) Bacilos espessos e longos

( ) Bacilos curtos e finos

AULA PRÁTICA: TÉCNICAS DE SEMEADURA

DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA

PROF. DR. LUIS CARLOS F. CARVALHO

Objetivo: Desenvolver as técnicas básicas de semeadura de material para isolamento de
germes

Princípio: Uma população microbiana, sob condições naturais, contém muitas espécies
diferentes. Os microbiologistas devem ser capazes de isolar, enumerar, e identificar os microrganismos em uma amostra, para então classificá-los e caracterizá-los.

Os microrganismos na natureza normalmente existem em cultura mistas, com muitas espécies diferentes ocupando o mesmo ambiente.

Ao determinar as características de um microrganismo, ele deve estar em cultura pura, ou seja, em que todas as células na população são idênticas no sentido de que elas
se originaram de uma mesma célula parental.

Em laboratório, os microrganismos são cultivados ou desenvolvidos em material
nutriente denominado meio de cultura. O tipo de meio utilizado depende de vários
fatores :

- Considerações sobre a origem do material a ser analisado;

- A espécie que se imagina estar presente nesta amostra;

- As necessidades nutricionais dos organismos.

Material: Alça de platina, meio sólido em placa (ágar Mueller-Hinton, ágar sangue, EMB, etc.,), tubos contendo 10ml de meio Mueller-Hinton, pipetas de 1ml, tubos com 4,5ml de salina estéril, alça de Drigalsky, bico de Bunsen, swab esteril, galeria para tubos de ensaio, placas de Petri estéreis, becker de 100ml com álcool, estufa a 37ºC, banho-maria a 100ºC, material biológico (saliva, sec. nasal, sec. ouvido, sec. orofaringe, fezes, urina, etc.)

Métodos:

Técnica de Esgotamento: A mais utilizada para isolamento de germes em meio sólido (ágar sangue, ágar EMB, etc ), onde se utiliza uma alça de platina, previamente flambada e esfriada.

- Com a alça de platina, tocar suavemente na amostra;

- Passar a alça sobre o meio de cultura em movimento de zigue-zague sem sobrepor aslinha e sem recarregar a alça (tomar cuidado para não ferir o meio de cultura);

- Incubar as placas a 37ºC por 24 a 48 horas;

Espalhamento “Pour Plate”: Consiste em fazer uma prévia diluição da amostra e
colocar em uma placa de Petri vazia e depois derramar o meio sobre a amostra e agitar para homogenizar a amostra diluída com o meio de cultura.

Técnica:

- Fazer diluição seriada da amostra, ex. 1/10, 1/100 e 1/1000;

- Colocar 1 ml de cada diluição em uma placa de Petri estéril;

- Fundir 10 ml de meio sólido e refriar a 65ºC;

- Derramar sobre a amostra na placa e aplicar movimentos suaves na placa para misturar a amostra com o meio;

- Esperar o meio solidificar novamente e incubar as placas a 37ºC por 24 a 48 horas.

Espalhamento Pós Plate: Consiste em espalhar a amostra diluída ou não sobre o meio com auxílio da alça de Drigalsky, para obter colônias isoladas.

Interpretação: Observar as colônias isoladas, caracterizadas pela formação de pontos
isolados sobre o meio de cultura, após a incubação.

Recomendações Para Semeadura de Material Biológico:

Para execução de uma boa semeadura, certas precauções especiais devem ser
observadas pelo manipulador, com o fim de preservar a pureza do cultivo e minimizar os riscos de infecção ou intoxicação no Laboratório:

• Todo processo deve ser feito em ambiente limpo e desinfectado, próximo de uma
chama “azul” de um bico de Bunsen, ou então dentro de uma câmara de fluxo laminar;

• Alça de platina utilizada para semear, deve ser flambada antes e depois da semeadura;

• As placas semeadas devem ser incubadas com tampa invertida para não haver
transpiração do meio sobre a tampa

• Regular a entrada de ar do bico de Bunsen, para obter uma chama azul ( zona de
esterilidade);

• Os tubos ou recipientes com meios de cultura, estéreis ou com material a ser
inoculado, deverão ser abertos ou manipulados, somente na proximidade da chama
do bico de Bunsen (zona estéril);

• As manipulações devem ser feitas, preferencialmente, por trás da chama do bico de
Bunsen.

• As alças ou agulhas, de platina ou níquel-cromo, devem ser flambadas imediatamente
antes e depois de qualquer transferência. Elas devem ser flambadas em todo seu comprimento, a partir de alguns centímetros do cabo de Kolle, até ao rubro, mantendo-as em posição vertical à chama do bico de Bunsen. Nunca iniciar a flambagem pela extremidade livre da alça ou agulha. Deixar esfriar nas proximidades da chama;

• Passar, ligeiramente, dentro da chama do Bico de Bunsen, imediatamente antes e depois da transferência, pipetas graduadas estéreis, pipeta Pasteur, ou alça de Drigalsky;

• Nunca abrir ou deixar aberto verticalmente os tubos ou frascos com culturas, incliná-
los a aproximadamente em ângulo de 30º;

• No caso de tubo com ágar inclinado, este deve ficar de preferência na horizontal.
Flambar também a boca dos tubos ou frascos contendo culturas e meios,
imediatamente antes e depois da transferência;

• Nunca depositar a tampa ou tampão de algodão dos tubos ou frascos sobre a bancada
ou mesa de trabalho;

AULA PRÁTICA: PREPARO DE MEIOS DE CULTURAS

DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA

PROF. DR. LUIS CARLOS F. CARVALHO

Objetivo: Familiarizar o aluno com o preparo dos meios de cultura mais usados em microbiologia; Discutir a aplicação de meios específicos para o cultivo de microrganismos distintos

Princípio: Os microrganismos, para um crescimento adequado, necessitam de nutrientes (fontes de carbono, nitrogênio, enxofre, fosfato, etc., ) e condições ambientais favoráveis (pH, pressão osmótica, temperatura, umidade, etc.,).

Meios de cultura são associação qualitativa e quantitativa de substâncias que permitem o cultivo de microrganismos fora do meio natural. Em condições naturais, nos diversos “habitats”, os microrganismos ocorrem em populações mistas. Os meios de cultura permitem isolar os microrganismos para estudo e pesquisa.

Material: Peptona, extrato de carne, ágar-agar, ágar Mueller-Hinton, Caldo BHI, sangue de carneiro desfibrinado, tubos contendo 10ml de ágar-base estéril PH-metron, placas de Petri estéreis, pipetas de 1ml estéril, balança, provetas.

Equipamentos: Autoclave, cronômetro, Banho-Maria a 55ºC

Ágar Mueller Hinton

Modo de preparação:

Suspender 38,0g em 1000ml de água destilada ou deionizada e aquecer até ebulição para dissolver completamente. Esterilizar em autoclave durante 10 min, a 15 atm de pressão (121ºC), esfriar a 50ºC e distribuir em placas de Petri.

Comentários:

Desde o inicio, os microbiologistas aprenderam que podiam cultivar uma grande variedade de bactérias em “caldos”, obtidos pela cocção de tecidos animais ou vegetais. Em 1923, Mueller, tentando definir esta vaga necessidade, em termos de compostos específicos, descobriu o então desconhecido aminoácido, metionina. A nutrição bacteriana tornou-se campo dinâmico durante os anos subsequentes; porém com o reconhecimento da unidade bioquímica, os vários esquemas nutritivos revelaram ser simplesmente pequenas variações de um tema central e o estudo da nutrição bacteriana perdeu muito de seu interesse teórico. Apesar disso, este campo detém sua importância prática e ainda apresenta desafios; por exemplos, o bacilo da lepra, o treponema da sífilis e riquétsias não podem ser cultivados em meios artificiais.

Inicialmente, o único método existente para contagem de bactérias ou para o isolamento de culturas puras (clones), era a diluição até a extinção, isto é, até a perda da infectividade. Um progresso importante foi a introdução dos meios sólidos por Koch. Os materiais usados inicialmente eram pouco satisfatórios: a superfície da batata cortada podia permitir um crescimento confluente, enquanto que a gelatina permanecia sólida apenas em temperaturas relativamente baixas, sendo liquefeita por muitos microrganismos. Assim sendo, Frau Hesse, esposa de um médico e bacteriologista amador alemão, introduziu o ágar, um produto japonês que ela empregava para engrossar as sopas.

O ágar (do malaio “ágar-ágar”) é um polissacarídeo obtido de certas algas marinhas (várias algas vermelhas). Constitui-se primariamente de galactose, com um radical sulfato para cada 10 ou 50 resíduos.

O ágar mostrou-se ideal para formar meios sólidos. Não é tóxico para a bactéria, e muito poucas conseguem atacá-lo. Em concentrações de 1,5 a 2,0% apresentam uma superfície úmida para permitir crescimento, mas seca o bastante para manter separadas as colônias (Excepcionalmente, certos microrganismos móveis, como Proteus, exigem ágar a 5% para impedir a formação do véu. Após a fusão entre 80 e 100ºC, as soluções de ágar permanecem líquidas até 45-50ºC, temperatura que muitas bactérias toleram por alguns instantes; após a solidificação em temperatura ambiente, permanecem sólidas até muito acima de 37ºC. A estrutura fibrosa de um gel é suficientemente compacta para impedir a movimentação de bactérias no seu interior, mas bastante aberta para permitir a difusão, até mesmo de nutrientes macromoleculares.

O meio de cultura pode ser líquido ou sólido, e em laboratório geralmente é usado o Ágar-agar;

Foi-nos apresentados em laboratório o Ágar-agar (polissacarídio complexo obtido de alga marinha vermelha). Ele é utilizado como agente solidificante e altamente nutritivo para os microrganismos e não se degrada facilmente com a ação destes.

Na prática, usou-se esse composto misturado a água para formar uma solução gelatinosa. Para calcular quanto se deveria usar do composto, faz-se uma regra de três simples.

O preparo normal geralmente é de 1000 ml de água para cada 90 gramas de Ágar-agar e seguindo essa regra, usou- se 13 g do Ágar-agar para cada 150 ml, que foi devidamente pesado e colocado no dentro do erlenmayer para formar a solução.

Logo em seguida o erlenmayer foi coberto com um papel cartolina e juntamente com as placas de petri devidamente embalados foram colocados dentro da autoclave.

Seguindo todos os passos de segurança e lacrada corretamente, a solução preparada foi esterilizada a pressão de 1 atm à 121 °C por 15 min.

AULA PRÁTICA: COLORAÇÃO SIMPLES

DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA

PROF. DR. LUIS CARLOS F. CARVALHO

Princípio: A coloração simples tem bases físico-químicas. A impregnação de uma célula por um corante pode ser entendida a partir de fenômenos como a capilaridade, osmose, adsorsão e absorção. Mas, é sobretudo pela compreensão de certas reações de corantes de organóides, inclusões e estruturas celulares que se firmam as bases desta metodologia. Desta forma é observada uma reação estequiométrica entre corantes e uma dada estrutura, por força da afinidade de suas cargas opostas. Normalmente o que é uma reação de dupla troca de cátions e anions, do tipo:

(Microrganismos)- (Na+ , K+ , etc) + (cromóforos) → (microrganismo)- (cromóforos) + + (Na+ K+ , etc. ) + (Cl- , oxalato, etc) Material: Material biológico2 em suspensão, lâminas, lamínulas, microscópio, pipeta Pasteur (ou contagotas), corante (azul de metileno, verde malaquita, Giemsa, etc)

Material: Material biológico em suspensão, lâminas, lamínulas, microscópio, pipeta Pasteur (ou contagotas), corante (azul de metileno, verde malaquita, Giemsa, etc)

Método: Fazer um esfregaço com o material biológico. Esperar secar. Fixar ao calor . Cobrir o esfregaço com o corante. Esperar por 1 a 5 min. Lavar com água, secar o observar ao microscópico com objetiva de imersão.

Interpretação: Anotar as suas observações, tais como presença de células, afinidade pelo corante, forma e disposição dos microrganismos, etc.

Comentários: Sob o ponto de vista químico, os corantes são substâncias orgânicas possuidoras de grupamentos cromóforos que podem conferir aos corpos celulares uma dada pigmentação. Os corantes são classificados em três grupos, de acordo com a carga do íon da porção corante da molécula. Assim, são corantes ácidos os que têm uma carga negativa; básicos os que tem cargas positivas e neutros os que são, portanto, eletricamente neutro.

Em bacteriologia, os corantes básicos são os mais empregados. Isto justifica-se pela presença de cargas elétricas, negativas, ao longo do corpo celular, o que demonstra a afinidade por este tipo de corantes.

Iniciamos o processo de coloração simples realizando um esfregaço de cera de ouvido, com o auxílio de cotonete, na lâmina.

Com o auxílio de um prendedor de roupa, pegamos a lâmina com o material biológico e o aquecemos com uma vela acesa.

Após isso, cobrimos o material com o corante azul metileno, e aguardamos 5 min.

Lavamos levemente a lâmina com água e esperamos secar.

O corante facilitou a visualização do material, por meio do microscópio, deixando em evidência as estruturas de micro-organismos que não eram possíveis visualizar apenas aplicando na lâmina.

Questões:

1. Os meios de cultivo e a idade da colônia exercem alguma influência na morfologia de células em coloração simples?

R: O meio de cultura é uma preparação muito utilizada em laboratórios, que tem por objetivo fornecer aos micro-organismos o local perfeito para o seu crescimento. A idade de colônia é uma unidade de medida usada para estimar o número de bactérias ou fungos viáveis - isto é, capazes de se multiplicar mediante fissão binária sob condições controladas - de uma amostra. O objetivo básico da coloração simples é mostrar toda a estrutura do microrganismo incluindo a forma e as estruturas básicas.

De forma resumida, a coloração simples, por afinidade a alguns componentes de determinadas bactérias, permitirá a melhor visualização destas. Porém há informações e preparos que devem ser feitos para que a coloração seja realizada de maneira correta, como os que são citados no enunciado.

2. A coloração simples se presta a identificação de uma cultura mista de microrganismos? Que observações poderiam ser obtidas?

R: O objetivo é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis. É mais frequentemente usada na verificação das características morfológicas das bactérias. Apresenta vantagens como: células mais facilmente visíveis após coloração, podem ser evidenciadas diferenças entre células de diferentes espécies ou dentro da mesma espécie pelo uso de soluções corantes apropriadas.

3. Qual a aplicação da coloração simples no Diagnóstico Laboratorial de doenças infecciosas?

R: As bactérias, que podem causar doenças infecciosas, são praticamente incolores, não apresentando contraste suficiente, o que dificulta sua visualização. A diferença química entra as bactérias e o meio é que nos permite distingui-las por técnicas de coloração. O exame microscópico do tecido pode ser necessário para distinguir doença invasiva de colonização de superfície. A distinção não é facilmente alcançada por métodos de cultura.

4. Cite exemplos de Doenças Infecciosas e seu agente infecioso que são diagnosticados seguramente por uma coloração simples?

R: Parasitas no sangue; Histoplasma capsulatum nos fagócitos e nas células teciduais; Inclusões intracelulares formadas por vírus e clamídias; Trofozoítos de Pneumocystis jirovecii; algumas bactérias intracelulares

5. Cite alguns cuidados, a serem tomados para a execução satisfatória da coloração simples.

R: Para que a coloração seja apresentada corretamente, deve-se cumprir as etapas de preparação com veemência, atentando-se para o manejo correto do esfregaço, que deve estar fixado e coberto com a solução corante por aproximadamente cinco minutos, após o qual a lâmina é lavada com água e devidamente seca. As células geralmente se coram uniformemente. Usar um dos corantes: Cristal violeta, azul de metileno, safranina. Atentar-se para o uso de máscara, luva e touca para não contaminar o material biológico.